Niederländische Forscher kombinieren CRISPR und Biolumineszenz in einem experimentellen Test fürInfektionskrankheiten

Ein neu entwickeltes nächtliches Protein könnte Forschern in den Niederlanden zufolge die Diagnose viraler Erkrankungen beschleunigen und vereinfachen.
Ihre am Mittwoch in ACS Publications veröffentlichte Studie beschreibt eine empfindliche, einstufige Methode zur schnellen Analyse viraler Nukleinsäuren und ihres Aussehens mithilfe leuchtend blauer oder grüner Proteine.
Die Identifizierung von Krankheitserregern durch den Nachweis ihrer Nukleinsäure-Fingerabdrücke ist eine Schlüsselstrategie in der klinischen Diagnostik, der biomedizinischen Forschung sowie der Überwachung der Lebensmittel- und Umweltsicherheit.Die weit verbreiteten quantitativen Polymerase-Kettenreaktionstests (PCR) sind hochempfindlich, erfordern jedoch eine aufwendige Probenvorbereitung oder Interpretation der Ergebnisse, was sie für einige Gesundheitseinrichtungen oder ressourcenbeschränkte Einrichtungen unpraktisch macht.
Diese Gruppe aus den Niederlanden ist das Ergebnis einer Zusammenarbeit zwischen Wissenschaftlern von Universitäten und Krankenhäusern zur Entwicklung einer schnellen, tragbaren und benutzerfreundlichen Nukleinsäure-Diagnosemethode, die in einer Vielzahl von Umgebungen angewendet werden kann.
Sie wurden von Glühwürmchenblitzen, Glühwürmchenglühen und winzigen Sternen aus aquatischem Phytoplankton inspiriert, die alle durch ein Phänomen namens Biolumineszenz angetrieben werden.Dieser im Dunkeln leuchtende Effekt wird durch eine chemische Reaktion verursacht, an der das Luciferase-Protein beteiligt ist.Die Wissenschaftler bauten Luciferase-Proteine ​​in Sensoren ein, die Licht aussenden, um die Beobachtung zu erleichtern, wenn sie ein Ziel finden.Dies macht diese Sensoren zwar ideal für die Point-of-Care-Erkennung, ihnen fehlt jedoch derzeit die hohe Empfindlichkeit, die für klinische Diagnosetests erforderlich ist.Obwohl die CRISPR-Genbearbeitungsmethode diese Möglichkeit bieten kann, sind viele Schritte und zusätzliche Spezialausrüstung erforderlich, um das schwache Signal zu erkennen, das in komplexen, verrauschten Proben vorhanden sein kann.
Forscher haben einen Weg gefunden, ein CRISPR-verwandtes Protein mit einem Biolumineszenzsignal zu kombinieren, das mit einer einfachen Digitalkamera erfasst werden kann.Um sicherzustellen, dass genügend RNA- oder DNA-Probe für die Analyse vorhanden war, führten die Forscher eine Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) durch, eine einfache Technik, die bei einer konstanten Temperatur von etwa 100 °F arbeitet.Sie entwickelten eine neue Plattform namens Luminescent Nucleic Acid Sensor (LUNAS), bei der die beiden CRISPR/Cas9-Proteine ​​spezifisch für verschiedene zusammenhängende Teile des viralen Genoms sind, an die jeweils oben ein einzigartiges Luciferase-Fragment angehängt ist.
Wenn das spezifische virale Genom, das die Forscher untersuchen, vorhanden ist, binden zwei CRISPR/Cas9-Proteine ​​an die Ziel-Nukleinsäuresequenz;Sie kommen in unmittelbarer Nähe zueinander, wodurch sich in Gegenwart eines chemischen Substrats ein intaktes Luciferase-Protein bilden und blaues Licht aussenden kann..Um den bei diesem Prozess verbrauchten Substratverbrauch zu berücksichtigen, verwendeten die Forscher eine Kontrollreaktion, die grünes Licht aussendete.Ein Röhrchen, das seine Farbe von Grün nach Blau ändert, zeigt ein positives Ergebnis an.
Die Forscher testeten ihre Plattform, indem sie den RPA-LUNAS-Assay entwickelten, der erkenntSARS-CoV-2-RNAohne langwierige RNA-Isolierung und demonstrierte seine diagnostische Leistung an Nasopharyngealabstrichproben vonCOVID 19Patienten.RPA-LUNAS konnte SARS-CoV-2 innerhalb von 20 Minuten in Proben mit einer RNA-Viruslast von nur 200 Kopien/μL erfolgreich nachweisen.
Die Forscher glauben, dass ihr Test viele andere Viren einfach und effektiv erkennen kann.„RPA-LUNAS ist attraktiv für die Point-of-Care-Testung von Infektionskrankheiten“, schrieben sie.